Pangunahing Pagkakaiba - PCR vs RT-PCR

Ang PCR at RT-PCR ay dalawang mahahalagang pamamaraan sa molekular biology. Ang PCR ay binuo ni Kary Mullis noong 1980s. Ito ay may kakayahang dagdagan ang bilang ng mga kopya ng isang partikular na gene sa isang exponential na paraan, pinapabilis ang pagtuklas ng partikular na fragment ng DNA. Ang Taq Polymerase ay ang enzyme na pinaka-madalas na ginagamit sa mga system ng PCR. Ito ay isang termostable na enzyme. Sa RT-PCR, ang reverse transcription ay sinusundan ng PCR. Ang enzyme, reverse transcriptase ay kasangkot sa pagbubuo ng komplementaryong DNA mula sa RNA. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng PCR at RT-PCR ay iyan Gumagamit ang PCR ng dobleng-straced na DNA bilang isang template samantalang ang RT-PCR ay gumagamit ng RNA bilang isang template.

Saklaw ng Mga Susing Lugar

1. Ano ang PCR - Kahulugan, Proseso, Application 2. Ano ang RT PCR - Kahulugan, Mga Katangian, Application 3. Ano ang pagkakaiba sa pagitan ng PCR at RT PCR - Paghahambing ng Mga Pangunahing Pagkakaiba

Pangunahing Mga Tuntunin: PCR, RT-PCR, Polymerase Chain Reaction, Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction, DNA Template, DNA Polymerase, Denaturation, Annealing, Primer Extension

Ano ang PCR

PCR (Reaksyon ng Polymerase Chain) ay isang medyo simple ngunit rebolusyonaryong pamamaraan. Gumagamit ang PCR ng kakayahan ng enzyme, DNA polymerase na synthesize ng mga bagong hibla ng DNA sa isang pantulong na paraan sa inaalok na strand ng template. Ang PCR ay isang kailangang-kailangan na pamamaraan na ginamit sa parehong mga klinikal at pananaliksik na mga laboratoryo para sa pagganap na pagtatasa ng mga gen, diagnosis, at pagsubaybay sa mga namamana na sakit, pag-clone ng DNA, pagsunud-sunod, at sinaunang pagpapalaki ng DNA. Ang template ng DNA, mga nucleotide, primer, at DNA polymerase ay ang apat na pangunahing mga bahagi ng PCR. Ang Template ng DNA ay karaniwang isang dobleng-straced DNA na may target na pagkakasunud-sunod, na kung saan ay upang amplified. Taq DNA polymerase na kung saan ay nakahiwalay mula sa Thermus aquatics ay karaniwang ginagamit sa PCR. Ang Pfu DNA polymerase ay isa pang uri ng DNA polymerase na may mataas na katapatan. Parehong lumalaban sa init ang parehong Taq at Pfu polymerases. Ang mga nucleotide na idinagdag ng DNA polymerases ay adenine (A), guanine (G), cytosine (C), at thymine (T). Dahil ang DNA polymerase ay maaari lamang magdagdag ng isang bagong nucleotide sa isang 3 end ng isang paunang mayroon ng DNA strand, kinakailangan ng isang oligonucleotide primer para sa pagsisimula ng synthesis ng DNA. Ang kinakailangan ng isang panimulang aklat sa PCR ay nagbibigay-daan sa pagtukoy lamang ng isang tukoy na rehiyon sa template. Ang pagkakasunud-sunod ng target ay flanked ng pasulong at baligtarin ang mga primer. Sa pagtatapos ng isang PCR, ang mga bagong kopya na tinatawag na mga amplicon ng isang tukoy na pagkakasunud-sunod ng DNA ay naipon sa bilyun-bilyon. Ang mga bahagi ng PCR ay dapat na na-optimize sa isang paraan upang mapabuti ang pagganap ng PCR habang pinapaliit ang pagkabigo.

Ang PCR ay isang awtomatikong proseso na ginagawa ng mga thermal cycler, na may kakayahang lumipat sa pagitan ng iba't ibang mga temperatura. Ang PCR ay isang proseso ng tatlong hakbang.

1. Denaturation - Ang dobleng straced na template ng DNA ay pinaghiwalay sa dalawang solong mga hibla sa pamamagitan ng pag-init sa 94-95 ° C.
2. Annealing - Ang pasulong at baligtad na mga primer ay nagbubuklod sa mga pantulong na pagkakasunud-sunod sa template. Ang temperatura ng hakbang na ito ay nakasalalay sa temperatura ng pagkatunaw ng kombinasyon ng panimulang aklat.
3. Panimulang extension - Ang DNA polymerase enzyme ay nagpapalawak ng bawat isa sa mga primer sa kanilang 3'end sa pamamagitan ng pagdaragdag ng mga pantulong na base sa lumalaking strand. Ang pinakamainam na temperatura ng Taq polymerase, 72 ° C ay ginagamit bilang temperatura sa hakbang ng extension. Ang oras ng extension ay nakasalalay sa bilang ng mga pares ng base sa strand ng template.

Ang tatlong mga hakbang ay paulit-ulit para sa 28-35 beses.

Larawan 1: Reaksyon ng Polymerase Chain

Ang mga produkto ng PCR ay sukat ng maliit na bahagi ng agarose gel electrophoresis kumpara sa isang hagdan ng DNA. Ang visualization ng DNA sa isang agarose gel ay ginagawa sa pamamagitan ng paglamlam sa ethidium bromide at pagmamasid sa ilalim ng UV. Ang pinalakas na mga banda ng DNA sa ilalim ng UV sa isang ethidium bromide-stained gel ay ipinapakita sa pigura 2. Ang hagdan ng DNA ay ipinapakita sa kaliwang balon.

Larawan 2: Mga banda ng DNA

Ano ang RT-PCR

RT-PCR (Reverse transcription-polymerase chain reaction) ay isa sa mga pinaka-sensitibong pamamaraan na ginamit para sa pagtuklas ng mRNA. Ang RNA ay ang naaangkop na template para sa pagkalap ng impormasyon alinman sa pagpapahayag ng gene ng isang normal na tisyu o ang pagpapahayag ng gene ng isang nahawaang tisyu. Ang template para sa RT-PCR ay maaaring alinman sa kabuuang RNA o viral o bacterial RNA ayon sa pagkakabanggit. Ang RNA ay reverse transcript sa komplimentaryong DNA (cDNA) ng enzyme, reverse transcriptase. Ang pinakamainam na temperatura ng reverse transcriptase ay 46 ° C. Ang cDNA ay ginagamit sa PCR upang makuha ang produkto. Ang mga hakbang sa reverse transcription PCR ay ipinapakita sa figure 3.

Larawan 3: RT-PCR

Ang RT-PCR ay maaaring isagawa sa isang dalawang-hakbang o isang-hakbang na reaksyon. Sa dalawang hakbang na reaksyon, ang reverse transcription at PCR ay ginaganap sa dalawang magkakahiwalay na hakbang. Sa isang hakbang na RT-PCR, ang reverse transcription ay sinusundan ng PCR sa isang solong tubo sa isang sunud-sunod na pamamaraan. Ang parehong cDNA at pangwakas na produkto ng PCR ay maaaring patakbuhin sa isang agarose gel para sa mga layunin ng laki ng paghati at paggunita. Ang isang hakbang at dalawang hakbang na RT-PCR ay ipinapakita sa pigura 4.

Larawan 4: Isang hakbang at dalawang hakbang na RT-PCR

Pagkakaiba sa pagitan ng PCR at RT-PCR

Kahulugan

PCR: Ang PCR ay isang diskarteng ginamit sa molekular biology upang palakasin ang isang segment ng DNA na bumubuo ng milyun-milyong mga kopya ng isang pagkakasunud-sunod ng DNA.

RT-PCR: Ang RT-PCR ay isang variant ng PCR na ginamit sa pagtuklas ng ekspresyon ng gene sa molekular biology.

Mga hakbang

PCR: Ang Denaturation, annealing, at extension ay ang tatlong mga hakbang sa PCR.

RT-PCR: Sa RT-PCR, ang reverse transcription ay sinusundan ng PCR.

Template

PCR: Ang isang dalwang-maiiwan na DNA Molekyul ay nagsisilbing template para sa PCR.

RT-PCR: Ang isang solong-straced na RNA Molekyul ay nagsisilbing template para sa reverse transcription. Ang isang solong-strand na DNA Molekyul ay nagsisilbing template para sa PCR.

Ginamit ang mga enzim

PCR: Ginagamit ang DNA polymerase bilang enzyme sa PCR.

RT-PCR: Ang reverse transcriptase at DNA polymerase ay ginagamit bilang mga enzyme sa RT-PCR.

Mga Panimula

PCR: Ang mga pasulong at baligtad na primer ay ginagamit sa PCR.

RT-PCR: Ang reverse primer lamang ang ginagamit para sa reverse transcription at ang parehong forward at reverse primers ay ginagamit sa PCR.

Pagkamapagdamdam

PCR: Ang PCR ay isang sensitibong pamamaraan.

RT-PCR: Ang RT-PCR ay mas sensitibo sa PCR na iyon.

Mga Aplikasyon

PCR: Ginagamit ang PCR sa pagganap na pag-aaral ng mga gen, diagnosis, at pagsubaybay sa mga sakit na namamana, pag-clone ng DNA, pagsunud-sunod ng DNA, at sinaunang pagpapalaki ng DNA.

RT-PCR: Ginagamit ang RT-PCR sa pagtuklas ng ekspresyon ng gene.

Konklusyon

Ang PCR at RT-PCR ay ang dalawang mahahalagang diskarteng ginamit sa molekular biology. Ang parehong PCR at RT-PCR ay mga automated na diskarte na may kakayahang pagtaas ng exponentially ang bilang ng mga kopya ng isang target na pagkakasunud-sunod ng DNA, na tinukoy ng mga pasulong at baligtad na primer. Sa PCR, ang dobleng-straced na DNA ay ginagamit bilang template. Sa pamamagitan ng PCR, DNA cloning, DNA sequencing, at functional analysis ng mga genes ay maaaring magawa. Sa RT-PCR, ang expression ng gene sa isang partikular na tisyu ay maaaring sundin sa pamamagitan ng pagpapalakas ng RNA. Ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng PCR at RT-PCR ay sa kanilang mga template na ginamit sa bawat reaksyon at kanilang mga aplikasyon.

Sanggunian:

1. "Polymerase Chain Reaction (PCR)." Pambansang Center para sa Impormasyon ng Biotechnology. U.S. National Library of Medicine, n.d. Web Magagamit dito. 01 Hunyo 2017. 2. "Polymerase Chain Reaction (o PCR)." Pag-clone at Molecular na Pagsusuri ng mga Genes. N.p., n.d. Web Magagamit dito. 01 Hunyo 2017. 3. Biolabs, New England. "CDNA Synthesis & RT-PCR." CDNA Synthesis at RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web Magagamit dito. 01 Hunyo 2017.

Kagandahang-loob ng Larawan:

1. "Polymerase chain reaction" Ni Enzoklop - Sariling gawain (CC BY-SA 3.0) sa pamamagitan ng Commons Wikimedia 2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." Ni Rainis Venta - Sariling gawain (CC BY-SA 3.0) sa pamamagitan ng Commons Wikimedia 3. "Reverse transcription polymerase chain reaction" Ni Jpark623 - Sariling gawain (CC BY-SA 3.0) sa pamamagitan ng Commons Wikimedia 4. "Isang hakbang kumpara sa dalawang hakbang RT-PCR ”Ni Jpark623 - Sariling gawain (CC BY-SA 3.0) sa pamamagitan ng Wikimedia Wikimedia