Ang pagkakasunud-sunod ng DNA ay isang pamamaraan na ginamit upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng isang partikular na fragment ng DNA. Ang Sanger sequencing at susunod na henerasyon ng pagkakasunud-sunod ay dalawang uri ng mga pamamaraan ng pagsunud-sunod. Ginagamit ang mga fluorescent marker upang makilala ang bawat nucleotide sa pagkakasunud-sunod. Ginagamit ang PCR para sa pagsasama ng mga fluorescent marker sa fragment ng DNA. Ang PCR (polymerase chain reaction) ay isang pamamaraan na ginamit sa laboratoryo upang makagawa ng milyun-milyong mga kopya ng isang partikular na fragment ng DNA. Ang pag-aaral ng mga fragment ng PCR sa gel ay nagbibigay-daan sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng fragment ng DNA.

Saklaw ng Mga Susing Lugar

1. Ano ang Sequencing - Kahulugan, Mga Uri ng Sequencing - Susunod na Henerasyon na Pagkakasunud-sunod, Sanger Sequencing 2. Bakit Ginagamit ang PCR sa Proseso ng Sequencing ng DNA - Pagsasama ng Fluorescent Dyes Sa panahon ng PCR

Pangunahing Mga Tuntunin: ddNTPs, dNTPs, DNA Sequencing, Fluorescent Dyes, Next-Generation Sequencing, PCR, Sanger Sequencing

Ano ang Sequencing

Ang pagkakasunud-sunod ay isang pamamaraan ng laboratoryo na ginamit upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng isang Molekyul. Ang Sanger sequencing at susunod na henerasyon ng pagkakasunud-sunod ay ang dalawang pangunahing pamamaraan ng pagsunud-sunod ng DNA. Ang parehong mga pamamaraan ng pagsunud-sunod ng DNA ay kasangkot sa pagsasama ng mga gumagawa ng fluorescent sa DNA strand ng PCR para sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng isang partikular na DNA strand.

Sanger Sequencing

Ang unang pamamaraan ng pagsunud-sunod, na kilala bilang Sanger sequencing, ay unang binuo ni Fredric Sanger noong 1975. Dahil dito, kilala ito bilang Sanger sequencing. Ang pagsunud-sunod ng sanger ay kasangkot sa pumipili na pagsasama ng chain-terminating dideoxynucleotides (ddNTPS) ng DNA polymerase habang in vitro DNA synthesis. Samakatuwid, kilala rin ito bilang paraan ng pagwawakas ng kadena. Ginagamit ang regular na deoxynucleotides (dNTPs) para sa pagpahaba ng strand ng DNA. Ang mga ddNTP ay idinagdag din sa pinaghalong reaksyon para sa pagwawakas ng paglaki ng kadena. Ang apat na uri ng ddNTPs ay idinagdag sa apat na magkakahiwalay na PCR mixtures. Samakatuwid, ang apat na magkakahiwalay na reaksyon ng PCR ay isinasagawa sa pamamagitan ng pagdaragdag ng ddATP, ddGTP, ddCTP, at ddTTP. Para sa bawat pinaghalong reaksyon, isang solong uri ng idinagdag na ddNTP (kung idinagdag ang ddATP), ang paglago ng iba't ibang mga amplicon ay natapos sa bawat (A) nucleotide sa fragment ng DNA. Pagkatapos ang apat na reaksyon ay pinaghihiwalay ng gel electrophoresis. Ang naglalabas na fluorescence ay napansin ng isang fluorometer. Ang Sanger sequencing ay malawakang ginagamit para sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng mga fragment na ginamit sa pag-clone ng DNA at ang mga fragment na pinalakas ng PCR. Ang pangkalahatang pamamaraan ng Sanger sequencing ay ipinapakita sa pigura 1.

Larawan 1: Pangkalahatang Proseso ng Sanger Sequencing

Susunod na henerasyon ng Sequencing

Ang pagsunud-sunod ng susunod na henerasyon ay ang sama na pangalan para sa pinakabagong mga teknolohiyang pagsunud-sunod ng DNA. Ang maraming mga reaksyon ng pagsunud-sunod ay ginaganap sa microscale sa isang maliit na tilad nang magkakasunod sa pagsunud-sunod ng susunod na henerasyon. Ang parehong mga pamamaraan ng pagsunud-sunod ay gumagamit ng may label na mga nucleotide na may fluorescence na isinasama sa amplicon sa panahon ng PCR, na nagpapahintulot sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide. Ang pagtatapos ng kadena ng pagdaragdag ng mga marka ng fluorescent ay kasangkot din sa susunod na henerasyon ng pagkakasunud-sunod. Gayunpaman, ang pangunahing pagkakaiba sa pagitan ng Sanger sequencing at susunod na henerasyon ng pagkakasunud-sunod ay ang paggamit ng capillary electrophoresis para sa paghihiwalay ng magkakaibang may label na mga amplicon sa susunod na henerasyon na pagkakasunud-sunod. Ang capillary electrophoresis ay isang analytical na paraan ng paghihiwalay kung saan pinaghiwalay ang mga molekula batay sa kanilang electrophoretic mobility.

Bakit Ginagamit ang PCR sa Proseso ng Sequencing ng DNA

Sa panahon ng pagkakasunud-sunod, ang mga fluorescent marker ay dapat na isama sa strand ng DNA para sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide. Ang pagsasama na ito ay nagaganap sa panahon ng PCR. Sa pangkalahatan, ang apat na uri ng dNTPs ay isinasama sa bagong synthesizing DNA strand sa panahon ng PCR. Ang kababalaghang ito ay ginagamit sa pagsunud-sunod ng DNA upang isama ang mga fluorescent na may label na dideoxynucleotides (ddNTPs) sa amplicon habang tinutukoy ang pagkakasunud-sunod ng DNA.

Sa pangkalahatan, ang isang halo ng regular na apat na base (dNTPs; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) ay idinagdag sa pinaghalong reaksyon ng PCR habang sinusunod ang DNA.

Bilang karagdagan, ang isa sa apat na dideoxynucleotides (ddNTPs; ddATP, ddGTP, ddCTP, at ddTTP) ay idinagdag bilang mga bahagi ng reaksyon ng PCR sa isang mababang konsentrasyon. Panghuli, ang apat na reaksyon ng PCR ay kailangang isagawa upang matukoy ang kumpletong pagkakasunud-sunod.

Larawan 1: Isang Natukoy na Sequence ng DNA

Ang Ang mga ddNTP ay kulang sa 3’-OH pangkat kung saan ang papasok na nucleotide ay idinagdag ng DNA polymerase. Samakatuwid, ang pagsasama ng ddNTP ay tinatapos ang paglago ng kadena. Kaya, sa bawat isa sa apat na reaksyon ng PCR, ang pagwawakas ng kadena ay nangyayari sa isang partikular na base. Ang mga ito Ang mga ddNTP ay isinasama din sa iba't ibang mga fluorescent na tina (Ang Ang ddATP ay may label na berdeng pangulay; ang Ang marka ng ddGTP ay may dilaw na tina; ang Ang ddCTP ay may label na asul, at ang Ang ddTTP ay may label na pula na pangulay). Ang pagsasama ng mga fluorescent dyes at ang chain termination ay nagaganap sa panahon ng PCR. Ang mga amplicon ay pinapatakbo sa isang gel, at ang gel ay na-scan para sa fluorescence ng isang fluorometer sa awtomatikong pagsunud-sunod para sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide.

Konklusyon

Ang pagkakasunud-sunod ng DNA ay isang pamamaraan ng laboratoryo na ginamit upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng isang partikular na fragment ng DNA. Ang pagsunud-sunod ng Sanger at pagsunud-sunod na susunod na henerasyon ay nagsasama ng iba't ibang mga fluorescent na tina sa fragment ng DNA para sa pagpapasiya ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide sa panahon ng isang PCR.

Sanggunian:

1. Adams, Jill U. "Mga Teknolohiya ng Sequencing ng DNA." Mga Balita sa Kalikasan, Pangkat ng Pag-publish ng Kalikasan, Magagamit dito. 2. "Sequencing DNA - Automated Sequencing With Fluorescent Dyes." Mga Artikulo sa JRank, Magagamit dito.

Kagandahang-loob ng Larawan:

1. "Sanger sequencing - pangkalahatan" Автор: Gumagamit: Fibatirahi - власна робота (CC BY-SA 1.0) sa pamamagitan ng Wikimedia Wikimedia [binago] 2. "Pagsunud-sunod ng DNA" Ni Sjef - Sariling gawain (Public Domain) sa pamamagitan ng Wikimedia Wikimedia